Добрый день, уважаемые читатели!
В предыдущей части статьи мы с вами подробно рассмотрели что такое родамины, где они используются и какими физико-химическими свойствами обладают. Сегодня мы продолжим наши эксперименты — попробуем модифицировать родамины и посмотрим как это повлияет на их свойства.
Кратко напомним, что основными широко распространёнными представителями родаминов являются родамин С и родамин Ж. Именно с ними мы и будем экспериментировать. Вообще в научной литературе описано достаточно много способов модификации родаминов, но мы начнём с одного из достаточно простых способов — бромирования.
1. Итак, для проведения первого опыта необходимо взять 1г родамина Ж и растворить в 50 мл 70% уксусной кислоты. Получится зеленовато-красный раствор с выраженной флуоресценцией.
Далее в полученный раствор необходимо добавить 2.5г пиридиния бромида пербромида и оставить перемешиваться раствор ещё на 1-2 часа для завершения процесса бромирования.
При растворении в реакционной среде пиридиний бромид пербромид диссоциирует с высвобождением молекулярного брома.
Образующийся бром является электрофильной частицей и атакует ксантеновое ядро родамина Ж.
При бромировании дополнительно в раствор можно добавить 0.5 мл 30% раствора перекиси водорода для повышения использования брома т.к. в процессе бромирования выделяется бромоводород. Перекись водорода вновь окисляет образующийся бромоводород до молекулярного брома.
Но при указанных в рецептуре пропорциях в этом нет особой необходимости — пиридиний бромид пербромид взят изначально с избытком.
Через 1-2 часа раствор необходимо в 2-3 раза разбавить холодной дистиллированной водой, отфильтровать на бумажном фильтре и обильно промыть осадок 2-3 раза холодной водой. После этого осадок сушится в темном месте при температуре 30-40 градусов Цельсия. По итогу получается порошок красно-коричневого цвета, показанный в подборке фото ниже.
А вживую процесс бромирования выглядит вот так:
Наиболее вероятный продукт бромирования согласно литературным данным — 4,5-дибромродамин Ж.
Прежде чем переходить к исследованию полученного 4,5-дибромродамина Ж рассмотрим кратко процесс бромирования родамина С. По своей сути процесс полностью идентичен предыдущему случаю.
2. Для проведения второго опыта необходимо взять 1г родамина С и растворить в 50 мл 70% уксусной кислоты. Получится оранжево-розовый раствор с выраженной флуоресценцией.
Далее в полученный раствор необходимо добавить 2.5г пиридиния бромида пербромида и оставить перемешиваться раствор ещё на 1-2 часа для завершения процесса бромирования. Аналогично первому опыту в раствор можно добавить 0.5 мл 30% раствора перекиси водорода для повышения использования брома, но и в данном опыте в этом также нет особой необходимости из-за изначального избытка бромирующего агента.
Через 1-2 часа раствор необходимо в 2-3 раза разбавить холодной дистиллированной водой, отфильтровать на бумажном фильтре и обильно промыть осадок 2-3 раза холодной водой. После этого осадок сушится в темном месте при температуре 30-40 градусов Цельсия. По итогу получается порошок вишнёвого цвета, показанный в подборке фото ниже.
А в живую процесс бромирования выглядит вот так:
А что же насчёт образующихся продуктов бромирования?
В отличие от родамина Ж, где положения 2 и 7 уже заняты, в родамине С они свободны. Соответственно в качестве продуктов реакции теоретически может образовываться как 2,7-дибромродамин С так и 4,5-дибромродамин С. Это связано в том числе и с тем, что аминогруппы в ксантеновом ядре являются сильными ориентантами первого рода и направляют электрофильную атаку брома в орто— и пара— положения.
Атака в орто-положения 4 и 5 является предпочтительной ввиду наличия стерических затруднений для атаки в положения 2 и 7. Для осуществления бромирования в положения 2 и 7 необходимы более жёсткие условия. Приводимые в литературе данные также подтверждают, что в мягких условиях образуется преимущественно 4,5-дибромродамин С.
Ну что же, бромированные родамины нами были получены и теперь можно провести с ними несколько экспериментов и сравнить с исходными (небромированными) родаминами.
Для начала попробуем растворить полученный 4,5-дибромродамин Ж в диметилформамиде (ДМФА). В подборке фото ниже показан внешний и флуоресценция 4,5-дибромродамина Ж и исходного родамина Ж при различных концентрациях.
Если смотреть слева на право, то первые 3 образца — это 4,5-дибромродамин Ж в ДМФА при концентрациях 5, 50 и 2000 мкМ. Вторые 3 образца — это исходный родамин Ж в ДМФА при концентрациях 5, 50 и 2000 мкМ.
По представленным фото хорошо видно, что цвет раствора и цвет флуоресценции бромированного родамина Ж значительно отличается от исходного родамина Ж при одинаковых концентрациях.
При этом интенсивность флуоресценции бромированного родамина Ж значительно ниже и наблюдается достаточно сильный батохромный (красный) сдвиг как во всем диапазоне концентраций, так и относительно исходного родамина Ж. В общем и целом такое поведение неплохо согласуется с литературными данными и является в том числе проявлением эффекта тяжёлого атома.
А что насчёт реальных спектров флуоресценции бромированного родамина Ж? Данные спектры представлены в подборке фото ниже: на первом фото — при концентрации 5 мкМ, на втором фото — при концентрации 50 мкМ, на третьем фото — при концентрации 2000 мкМ.
По представленным спектрам хорошо видно, что пик флуоресценции при низкой концентрации лежит на длине волны 580 нм, при средней концентрации — на длине волны 598 нм, а при высокой концентрации — на длине волны 620 нм. Таким образом, с повышением концентрации наблюдается тот самый батохромный (красный) сдвиг о котором мы упоминали чуть ранее. В первом случае 18 нм, а во-втором — ещё 22 нм т.е.суммарно 40 нм.
Напомним, что для исходного родамина Ж пик флуоресценции при низкой концентрации лежит на длине волны 568 нм, при средней концентрации — на длине волны 577 нм, а при высокой концентрации — на длине волны 601 нм. При этом суммарный сдвиг пика составляет 33 нм.
И в случае бромированного родамина Ж и в случае исходного родамина Ж при низкой концентрации мы наблюдаем флуоресценцию практически чистого мономера. При средней же концентрации наблюдается начало димеризации и пик флуоресценции смещается в область более длинных волн. А при высокой концентрации помимо димеризации протекает ещё и ощутимая агрегация — пик флуоресценции ещё сильнее смещается в область более длинных волн.
А что насчет 4,5-дибромродамина С? А вот с ним ситуация немного интереснее…
В подборке фото ниже представлен внешний вид и флуоресценция бромированного родамина С в ДМФА при концентрации 5 мкМ, 50 мкМ и 2000 мкМ.
По представленным фото хорошо видно, что при низкой и средней концентрации раствор бромированного родамина С в ДМФА прозрачен и не обладает флуоресценцией… И только при высокой концентрации раствор окрашен в оранжево-красный цвет с желтовато-оранжевой флуоресценцией.
Причина такого поведения бромированного родамина С полностью идентична исходному родамину С — в своей структуре они оба имеют свободную карбоксильную группу орто-положении относительно связи, соединяющей фенильное кольцо с ксантеновым ядром. В определённых условиях данная группа может обратимо замыкаться, образуя спироциклический лактон. При этом разрушается единая π-электронная система хромофора, и окраска вместе с флуоресценцией исчезает.
Равновесие между окрашенной (открытой) и бесцветной (лактонной) формами бромированного родамина С, точно так же как и у исходного родамина С, зависит от полярности растворителя, протон-донорной способности растворителя и концентрации самого бромированного родамина С. В апротонном ДМФА равновесие сдвинуто в сторону образования лактона, хотя и не на 100%. А введение в ксантеновое ядро тяжёлых атомов брома дополнительно сдвигает равновесие именно в сторону образования лактона.
При низкой и средней концентрациях бромированного родамина С доля открытой формы настолько мала, что мы не видим окраску раствора, не регистрируем флуоресценцию глазом и использованным спектрометром. Она ниже порога обнаружения. Раствор кажется бесцветным.
При высокой же концентрации бромированного родамина С абсолютное количество открытой формы возрастает — у раствора появляется окраска и флуоресценция.
В связи с этим спектры флуоресценции при низкой и средней концентрации снимем в водном растворе, подкисленном бромоводородной (либо соляной) кислотой до pH около 2. Это позволит сдвинуть равновесие в сторону образования открытой формы бромированного родамина С. А спектр флуоресценции при высокой концентрации снимем в ДМФА.
Полученные спектры представлены в подборке фото ниже: на первом фото — при концентрации 2000 мкМ, на втором фото — при концентрации 50 мкМ, на третьем фото… А нет третьего фото… Флуоресценция бромированного родамина С при концентрации 5 мкМ настолько низка, что чувствительности использованного спектрометра недостаточно для достоверного измерения спектра…
Немного выше мы отмечали, что введение тяжёлых атомов брома дополнительно смещает равновесие в сторону образования лактона. Именно по этой причине нам и не удалось снять спектр флуоресценции при низкой концентрации бромированного родамина С. Даже в подкисленном до pH ≈ 2 растворе практически весь бромированный родамин С остаётся в лактонной форме.
По представленным спектрам хорошо видно, что пик флуоресценции при высокой концентрации лежит на длине волны 594 нм, а при средней концентрации — на длине волны 578 нм. Таким образом, с повышением концентрации также наблюдается батохромный (красный) сдвиг, равный 16 нм. Аналогично предыдущим случаям, данный сдвиг также вызван образованием димеров и агрегатов родамина в растворе.
А теперь снова немного вспомним данные из предыдущей части статьи: для исходного родамина С пик флуоресценции при высокой концентрации лежит на длине волны 623 нм, а при средней концентрации — на длине волны 598 нм. При этом суммарный батохромный сдвиг пика составляет 25 нм при росте концентрации.
Ничего не кажется странным, если сравнить исходный родамин С и бромированный родамин С? А если попарно сопоставить данные результаты с предыдущими измерениями?
В случае родамина Ж бромированное производное излучает в более длинноволновой области, чем исходный родамин Ж. И для каждого из них по отдельности также наблюдается батохромный сдвиг при росте концентрации.
Бромированный же родамин С излучает в области более коротких волн, чем исходный родамин С, при попарном сравнении одних и тех же концентраций в идентичных растворителях. То есть наблюдается гипсохромный (синий) сдвиг у бромированного родамина С относительно исходного красителя.
Но почему же так происходит? Почему в случае бромированного производного не проявляется эффект тяжёлого атома?
Скорее всего причина ровно та же самая, по которой мы не смогли измерить спектр флуоресценции при низкой концентрации бромированного родамина С — равновесие тотально сдвинуто в сторону лактонной формы. Практически все молекулы бромированного родамина С не излучают в видимом спектре. Всё что мы наблюдаем — это флуоресценцию очень небольшого количества мономеров. В данном случае вклад концентрационных эффектов оказался намного выше, чем влияние эффекта тяжелого атома.
Ну и в заключении нашей статьи осталось только разобраться где же используются или могут использоваться подобные бромированные родамины. Вообще область их применения достаточно широка. Так, например, 4,5-дибромродамин С и его близкие аналоги используются при фотодинамической терапии рака. 4,5-дибромродамин Ж и его близкие аналоги используются в качестве инициатора фотополимеризации; используются в качестве хемосенсоров, фотокатализаторов и пр. Возможно о некоторых интересных применениях данных соединений мы еще поговорим в будущем отдельно, но это будет уже совсем другая история…
А на этом на сегодня всё! Спасибо, что дочитали до конца!
Список использованной литературы:
1. Пара слов о родаминах. Часть 2
2. Yoon J., Jung Y. J., Yoon J. B., Damodar K., Kim H., Shin M., Seo M., Cho D. W., Lee J. T., Lee J. K. The heavy-atom effect on xanthene dyes for photopolymerization by visible light // Polymer Chemistry. – 2019. – Vol. 10.– P. 5737–5742. – DOI: 10.1039/C9PY01252D
3. Pal P., Zeng H., Durocher G., Girard D., Li T., Gupta A. K., Giasson R., Blanchard L., Gaboury L., Balassy A., Turmel C., Laperrière A., Villeneuve L. Phototoxicity of some bromine-substituted rhodamine dyes: synthesis, photophysical properties and application as photosensitizers // Photochemistry and Photobiology. – 1996. – Vol. 63, No. 2. – P. 161–168. – DOI: 10.1111/j.1751-1097.1996.tb03008.x.
4. Wu L., Shi Y., Yu H., Zhang J., Li Z., Yang X.-F. Bromination-induced spirocyclization of rhodamine dyes affording a FRET-based ratiometric fluorescent probe for visualization of hypobromous acid (HOBr) in live cells and zebrafish // Sensors and Actuators B: Chemical. – 2021. – Vol. 337. – P. 129790. – DOI: 10.1016/j.snb.2021.129790.